Neinvazní metoda měření RP u rostlin

Neinvazní metoda měření redoxních potenciálů u rostlin

J. Benada, Kroměříž

Abstrakt

Redoxní potenciál (RP) byl dosud převážně měřen vpichem platinové  elektrody do pletiva rostlin. RP je možno měřit v některých případech i neinvazivní metodou  plíškovou platinovou elektrodou a srovnávací nasycenou kalometovou elektrodou umístěnými volně vedle rostlinných částí ponořených do vody. Umístěním pletiv do vody se navodí prostředí se sníženým obsahem kyslíku, dýchání buněk je podstatně  omezeno a RP klesá až ke spodní hodnotě dýchacího řetězce buňky. Práce uvádí návrh neinvazní metody měření redoxního potenciálu pro pokusy a předběžné výsledky s její aplikací na základní fyziologické pochody rostlin. Z měření vyplývá, že přenašeče elektronů činné při dýchání  jsou rozpustné ve vodě a difundují snadno z buněk do vnějšího prostředí. Nemůže se tedy jednat o  ubichinon, který je rozpustný v tucích a je vázaný na stěnu buněčnou. Přenašeče elektronů nejsou oxidovány přímo vzdušným kyslíkem, ale jen prostřednictvím dýchacích enzymů. Kyslík produkovaný fotosyntézou může z části zabránit  poklesu RP pletiv v hypoxii, stejně jako dusičnanový ion v exudátu kořenů.  RP i ve vnějším vodním  prostředí odráží vnitřní stav pletiv rostlin a lze jej použít pro vysvětlení celé řady základních fyziologických procesů. Dýchací procesy i změny RP probíhají relativně velmi rychle, např. pokles z +180 mV na –500 mV proběhne v některých případech i za 15 minut.

Klíčová slova: dýchání, kyslík, ubichinon, fotosyntéza, hypoxie, pšenice, ječmen, brambory, exudát

Úvod

Studium redoxního potenciálu (RP) bylo původně zahájeno pro vysvětlení změn odolnosti rostlin proti obligátním parazitům. V průběhu dalších prací bylo zjištěno, že RP může podstatně přispět k objasnění celistvosti rostliny (především určením směru transportu  auxinu) a celé řady dalších funkcí, např. dýchání buňky, výživy rostlin  atd. Na rozdíl od běžného pojetí RP ve fyzikální chemii, kdy se pro různé kombinace redoxních párů hledají konstantní hodnoty,  RP rostlinných pletiv  zavisí na dýchání a stále se mění.

V předchozích čtyřiceti letech (viz přehled publikací Benada 2008) bylo studium RP prováděno vpichem platinové (Pt) elekrody do svinutých listů obilnin a  jiných rostlin nebo  do tuhého pletiva (např. do hlíz brambor).

Vzhledem k možným námitkám, že  vpichem se může měnit redoxní stav rostlinných pletiv, bylo třeba ověřit měření redoxního potenciálu v případech, kdy Pt elektroda není zabodnuta do pletiva. Principiálně tento postup je možný, protože nosiče elektronů, které určují RP, jsou rozpustné ve vodě a snadno difundují do vnějšího prostředí, jak bylo možno odvodit z vysvětlení vztahu mezi parazitem a hostitelem  v dřívějších pracích (Benada 2008).

Následující práce uvádí návrh neinvazní metody měření redoxního potenciálu a předběžné výsledky s její aplikací  na základní fyziologické pochody rostlin. Výsledky jsou uvedeny  v předběžné formě proto, aby práce byla vodítkem pro následovníky, jak uspořádat pokusy.

 Metodika (návrh postupů a předběžné výsledky )

Neinvazivní metodu měření RP je možno použít především v podmínkách podstatného snížení přístupu vzduchu k rostlinným pletivům ponořením pletiv do vody. V následujících pokusech byla používána běžná vodovodní voda. Tato voda neobsahuje žádné redoxní systémy, které by reagovaly s redoxními systémy buňky. Je možno použít také destilovanou vodu, jejíž vodivost rozpuštěním difundujících látek z buněk, je dostačující. Ve vodovodní i destilované  vodě je rozpuštěn vzdušný kyslík, který by mohl reagovat s Pt elektrodou. Koncentrace této redoxní soustavy  je však nízká. Množství rozpuštěného kyslíku se bude měnit podle atmosférického tlaku. Toto bude  třeba učinit  předmětem dalšího výzkumu.

Hodnota vlastního RP redoxnímu systému difundujícího z buňky může být ovlivněna jen enzymaticky (dýcháním). Nosiče elektronů v buňce nereagují přímo s kyslíkem (oxidace), ale jen prostřednictvím dýchacích enzymů.

Redoxní potenciál (RP) byl měřen lesklou plíškovou platinovou elektrodou a srovnávací nasycenou kalomelovou elektrodou umístěnými volně vedle rostlinných částí ponořených do  vody. Hodnoty RP jsou uváděny v podobě přímo naměřené, bez přepočtu na hodnotu RP nasycené kalomelové elektrody (+244 mV).Všechny uváděné výsledky jsou z roku 2008. Pro jednotlivé druhy pokusů je uveden jen omezený počet měření nebo jen návrh pokusů a výsledky je třeba považovat za orientační.

1) RP klíčících semen v hypoxii

a)Obilky

Obilky pšeničné

Obilky ozimé pšenice a jarního ječmene byly naklíčeny a ponořeny do vody, ve které byl měřen RP (Tab.1)

Tabulka 1

Hodnoty RP ve vodě s naklíčenými obilkami

Dílčí závěr: Zjištěný RP odpovídá spodní hranici RP dýchacího řetězce NADH (RP kalomel. elektrody +240 mV - 560 mV =    standardní RP  NAD+NADH⁺ -320 mV)

b) Porovnat RP různých druhů a odrůd  obilnin nebo i různých druhů jiných rostlin, především hrachu, který má hypogeické dělohy,  a jiných zelenin,  sledování změn v čase.

c) Vliv navážky vyklíčeného zrna na rychlost poklesu RP, vliv teploty na rychlost reakce.

Navrhuji zkoušet teploty  5, 15, 20,  25, 35 ^oC.

d) Vliv  stupně naklíčení na rychlost poklesu RP.

e) Vliv povaření na reakci obilek (zničení enzymatického systému vařením)

Některé předběžné výsledky :

Ebi, naklíčené obilky byly  vařené 15 minut, vyjmuty z horké lázně a přelity studenou vodou 20 ^oC, ve které byl měřen RP. Hodnota RP pomalu klesala za 20 hod  z hodnot + na   ‑450 mV

Stejný postup byl použit i u ječmene odrůdy Jersey.: začátek měření 9,00 h +108 mV, 10.00 h +116 mV, 11.00 h +89 mV, za 20 hodin –314 mV

V dalším pokuse byl byly naklíčené obilky ječmene odrůdy Jersey přelity vařící vodou, pak přelity studenou vodou,ve které byl měřen RP. Hodnoty RP   za 2 hodiny poklesly na –446 mV

 Dílčí závěr:: Přenašeče elektronů (pravděpodobně fenolické látky) i příslušné enzymatické systémy   jsou relativně odolné  k působení vysoké teploty.

2) Vliv různé formy dusíku v živině na změnu RP při hypoxii

V publikovaných výsledcích (Benada 1995) dusičnanový ion po přelití vodou.zabránil poklesu RP exudátu z  kořenů  u rostlin obilnin vyrostlých  v pískové kultuře s jedním listem.

K novým pokusům  byly použity rostliny obilnin vyložené na filtrační papír do „rolád“ pro zkoušení zdravotního stavu osiva (pruhy filtračního papíru 10x50 cm, obilky vyloženy ve vzdálenost 2 cm od horního okraje, pak papír svinut do „rolády“, která byla postavena na podnos s nízkou vrstvou vody (Benada 1992)   Protože během klíčení  voda vzlínala filtračním papírem, bylo tím zajištěno aerobní prostředí kořenů a RP v prostředí kořenů byl vysoký, v hypoxii však rychle klesl.

a) Změna RP v eluátu kořenů ječmene pěstovaného v „roládách“ navozením hypoxie.

Ječmen Bodega: obilky  vyloženy do rolád na filtrační papír po 50 obilkách a v době, kdy délka listů byla cca 10 cm, byl změřen RP v oblasti kořenů. Byly naměřeny hodnoty +197 mV, +193 mV, +198 mV, +193 mV

Pak byly „rolády“ vloženy do kelímků o obsahu 200 m a zality  vodou až do úrovně obilek. Ta.2. .

Tabulka 2

RP vyklíčených rostlin ječmene po zalití vodou (hypoxie) dne 28.3.

Dílčí závěr: Rolády z filtračního papíru používané pro hodnocení klíčení obilek jsou vhodným  materiálem pro sledování vlivu formy dusíku na pokles RP.

b) Změna RP v eluátu kořenů obilnin pěstovaných  v „roládách“ navozením hypoxie a vliv různé formy dusíkatých solí

V době zahájení pokusů byla délka listů cca 40 mm. Rolády vloženy do kelímků o obsahu 200 ml a přelity vodou až do výše obilek. Soli s obsahem dusíku přidávány do kelímků v pevné formě v množství cca 0.2 g.Tab.3.

 Tabulka 3

Ovlivnění RP v eluátu z kořenů  rostlin s vytvořeným  prvním listem různými formami dusíkatých solí při hypoxii

Dílčí závěr: Aby se zabránilo poklesu RP, dusičnanová sůl  musí být přidána ke kořenům rostlin ponořeným do vody, které mají vytvořen první list. Rostliny nesmí být pěstovány v podmínkách zásobení dusíkatou výživou. Amonná sůl ani močovina nezastavila v podobných podmínkách pokles  RP.

c) Ovlivnění RP v eluátu z klíčících  obilek v podmínkách hypoxie  dusičnanovou solí

- pšenice Ebi, přídavek roztoku dusičnanu vápenatého   do kádinky, kam byly vloženy klíčící obilky (11.4.). Za 30 minut klesl RP na –540 mV

- jiný pokus: klíčící obilky Ebi, přídavek roztoku dusičnanu draselného , za 30 minut RP klesl na ‑372 mV

 Dílčí závěr: U klíčících obilek pšenice dusičnanový ion nezabránil poklesu RP.

d) Objasnit, proč  dusičnan brání poklesu RP v eluátu kořenů  jen u rostlin s vytvořeným prvním listem.

 Jaká je reakce rostlin s více listy?

e) Bude  RP exudátu z odříznutých  kořenů rostlin z „rolád“ bez listů po přídavku dusičnanu   v hypoxii klesat?

Tabulka 4

RP různých variant rostlin s listy a kořeny v hypoxii

Dílčí závěr: K poklesu RP v hypoxii stačí jen kořeny obilnin. Dusičnan zastaví pokles RP i v pokuse jen s kořeny, ale rostliny z rolád by měly být starší (delší listy - více dní pěstování). V ukázaném pokuse přídavek dusičnanu zabránil v různém stupni poklesu RP.

3) RP eluátu s vloženými listy a klasy  obilnin v hypoxii

a) Hypoxie u zelených listů

- Listy pšenice Briliant srolovány, dány do kádinky a přelity vodou :RP dne 26.5., v 8.30 h, +172 mV, 27.5., 8.00 h, +198 mV. Doplňkové měření RP v aerobních podmínkách, srolované listy propíchnuty Pt elektrodou, 26.5., 8.30 h, +78 mV spodní bod obratu +62 mV.

- Jarní ječmen Sebastian, listy srolovány a ponořeny do kádinky s vodou:

RP dne 23.5., 9.45 h, +172 mV, 11.00 h., +187 mV.

Doplňkový pokus 28.5., 7.00 h, začátek měření RP:+225, za 5 dní.- listy stále v kádince pod vodou. 9.00 h –595 mV

Dílčí závěr: U zelených listů obilnin RP v hypoxii neklesá. Uvolňuje se zřejmě kyslík produkovaný fotosytézou, který se využívá při dýchání.

Při uchování listů po delší době,  enzymy odumírají, kyslík není produkován a RP je na spodní hranici dýchacího řetězce.

b) Hypoxie u zelených klasů obilnin

Dne 9.6. do kádinky vloženy 2 zelené klasy kvetoucí pšenice, klasy stočeny, přelity vodou: 10.00 h, RP +29 mV, na této hodnotě zůstal RP aspoň půl hodiny. Měření následujícího dne 10.6., 6.30 h, –559 mV..

Dílčí závěr: Z pokusu plyne, že asimilace a produkce kyslíku v zelených klasech probíhá méně intenzivně než v listech.

c) Hypoxie u zelených listů jiných rostlin

- Listy máku stočeny, vloženy do kádinky, přelity vodou : 10.6., 10.00 h, RP +26 mV, 11.00 h , –42 mV, 11.6.,  7.00 h,  –307 mV, 12.6., 6.00 h, –541 mV.

Dílčí závěr: U máku v listech asimilace probíhá na nízké úrovni, takže v hypoxii RP klesá.

- Listy révy: zahájení 17.6., 7.00 h , 7.15 h, -93 mV, 8.00 h, + 7 mV, 8.30 h, + 30 mV

Listy bramboru: 8.00 h, –6 mV, 9.00 h, –37 mV , 10.30 h, +9 mV

Dílčí závěr: U révy a bramboru bude třeba vliv asimilace v hypoxii dále ověřovat.

4) Vliv hypoxie na RP orgánů, kde fotosyntéza neprobíhá  (jiných než kořeny obilnin)

- úkrojky bramboru vloženy do kádinky, přelity vodou: začátek 27.5., 11.00 h, +90 mV, 28.5., 8.00 h, –471 mV , 8.30 h, –507 mV

Dílčí závěr: u bramborové hlízy neprobíhá  fotosyntéza a uvolňování kyslíku, RP klesá na spodní hranici dýchacího řetězce

5) Návrh: Vliv teploty a intenzity světla na RP eluátu z pletiv v hypoxii

Dílčí závěr z pokusů s vlivem hypoxie na zelené části rostlin:

Poklesu RP při hypoxii zelených částí rostlin brání kyslík uvolňovaný při fotosyntéze. Pokusy byly prováděny v rozptýleném světle v laboratoři, kde intenzita světla i fotosyntézy je nízká. Různé orgány mají různou intenzitu fotosyntézy, tedy i produkci kyslíku. Navíc listy při měření RP byly stočeny do svitku, což snižuje přístup světla i fotosyntézy.

6) Ověření předpokladu, že eluát rostlinného pletiva má podobný RP jako samo pletivo:

Úkrojky bramborové hlízy vloženy do kádinky a přelity vodou. Měření RP provedeno Pt elektrodou zapíchnutou do pletiva nebo ponořené do eluátu mimo rostlinná pletiva. Výchozí stav 16.6., 7.00 h, –3 mV, 7.30 h –18 mV.(Tab.5)

Tabulka 5: Porovnání RP pletiv bramborové hlízy a eluátu z úkrojků hlízy.

Dílčí závěr: V pletivech bramborové hlízy i v eluátu z úkrojků byly naměřeny blízké hodnoty RP.

7) Změna RP v eluátu z bramborové hlízy po odstranění pletiv:

Úkrojky bramborové hlízy byly 18.6. ponořeny do vody v 7.00 h, 9.00 h, –290 mV, 9.30 h, –385 mV, úkrojky vyjmuty z vody, RP začal stoupat 9.35 h, –149 mV, RP stoupá: 9.45 h, – 67 mV, dne 19.6., v 7.00 h, RP –266 mV.

Dílčí závěr: RP závisí na dýchání pletiva, po odstranění pletiv z  eluátu RP stoupá, protože do eluátu proniká vzduch, který byl před tím spotřebováván . při dýchání pletiv. Pokles RP druhého dne (19.6) by snad bylo možno vysvětlit rozvojem mikroflóry v eluátu v podmínkách hypoxie.

Diskuze

RP i ve vnějším vodním  prostředí odráží vnitřní stav pletiv rostlin a lze jej použít pro vysvětlení celé řady základních fyziologických procesů.  Nosiče elektronů činné při dýchání jsou rozpustné ve vodě a difundují do vnějšího prostředí. Nemůže to být ubichinon, který je rozpustný v tucích a je vázaný na stěnu buněčnou., jak je obecně uváděno  ve většině příruček (např.Procházka a kol. 1998, Handbuch 1960)  Dýchací procesy i změny RP probíhají relativně velmi rychle, např. pokles z +180 mV na – mV i za 15 minut.

Hypoxie umožňuje prostřednictvím RP zjistit  řadu důležitých fyziologických procesů. Poněvadž oxidace i redukce nosičů elektronů je vázána na dýchací enzymy, je třeba počítat s poměrně značným rozptylem naměřených hodnot. Hodnota RP ve fyziologii rostlin je značně dynamický faktor, jak bylo vícekrát publikováno v dřívějších pracích (Benada 2008).   Difuze nosičů elektronů činné při dýchání pronikající  do vnějšího vodného prostředí je podstatnou součástí nové teorie o poznávání hostitele a parazita a podstaty odolnosti rostlin proti chorobám.(Benada 1991).

Závěr

V této práci byla pro měření redoxních potenciálů u rostlin použita neinvazivní metoda, která se zakládá na měření RP plíškovou platinovou elektrodou a srovnávací nasycenou kalomelovou elektrodou umístěnými volně, vedle rostlinných částí ponořených do vody. Práce prezentuje jak metodiky a výsledky již provedených laboratorních pokusů z roku 2008, tak návrhy na další experimenty.

Pro jednotlivé druhy pokusů je uveden jen omezený počet měření nebo jen návrhy pokusů a výsledky je třeba považovat za orientační. Výsledky jsou uvedeny v předběžné formě proto, aby práce mohla být vodítkem pro následovníky.

Jako základ pro další výzkum poslouží následující závěry:

1) Nosiče elektronů činné při dýchání jsou rozpustné ve vodě

2) Nosiče elektronů činné při dýchání difundují do vnějšího vodného prostředí

3) Nosičem elektronů činným při dýchání není ubichinon, protože je rozpustný v tucích a je vázaný na stěnu buněčnou.

4) Kyslík produkovaný při fotosyntéze se účastní v dýchacím procesu zelených pletiv ponořených do vody a projeví se i v RP

5) RP i ve vnějším vodním prostředí odráží vnitřní stav pletiv rostlin daný RP rostlin a lze jej použít pro vysvětlení celé řady základních fyziologických procesů

6) Dýchací procesy i změny RP mohou probíhat relativně velmi rychle např. pokles z +180 mV na –500 mV i za 15 minut

7) RP nosičů elektronů je měněn dýchacími enzymy a není přímo ovlivněn vzdušným kyslíkem

8) Hypoxie umožňuje prostřednictvím RP zjistit řadu důležitých fyziologických procesů

9) Rolády z filtračního papíru používané pro hodnocení klíčení obilek jsou vhodným materiálem pro sledování vlivu formy dusíku na pokles RP.

Literatura

Benada J.: Empflindlichkeit von Getreidesorten gegenüber Beizmittel. (Citlivost odrůd obilnin k mořidlům.) Bericht über die Arbeitstagung 1992 Gumpenstein.,

125-131

Benada J.: Measurement of redox potential in soil. Obilnářské listy (Cereal letters) 3: 48-49, 1995 (In Czech).

Benada J. Redoxní potenciál a pH u rostlin a jejich funkce v odolnosti rostlin k chorobám a v rostlinné fyziologii – přehled dosavadních výsledků.- Redox potential and pH  in plants and their function in the mechanism of resistance to diseases and in plant physiology. Review.Obilnářské listy (Cereal letters)16: 114-117, 2008

Benada J.: The nature of of resistance of plants to obligate parasites. Ochr.Rostl. 27: 9-14, 1991.

Procházka S. a kol.: Fyziologie rostlin, Praha , Academia 1998.

Handbuch der Pflanzenphysiologie. Heraubegeben von W. Ruhland, Band XII. Planzenatmung eischliesslich Gärungen und Säuerstoffwechsel. Teil 1.

Berlin, Springer-Verlag 1960.

Poděkování: Děkuji vedení Výzkumného ústavu v Kroměříži za poskytnutí prostoru k provedení pokusů.